Colline Sanchez, V. Jacquemond team – Sept. 27, 2019

Investigating sarcoplasmic reticulum function during skeletal muscle excitation-contraction coupling using fluorescent biosensors

KEYWORDS: skeletal muscle; excitation-contraction coupling; sarcoplasmic reticulum; ryanodine
receptor; fluorescent biosensors; membrane voltage; intracellular calcium.

Excitation-contraction (EC) coupling in skeletal muscle corresponds to the sequence of events through which muscle fiber contraction is triggered in response to plasma membrane electrical activity. EC coupling takes place at the triads; these are nanoscopic domains in which the transverse invaginations (t-tubules) of the surface membrane are in close apposition with two adjacent terminal cisternae of the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. More precisely, EC coupling starts with action potentials fired at the endplate, propagating throughout the surface membrane and in depth into the muscle fiber through the t-tubules network. When reaching the triadic region, action potentials activate the voltage-sensing protein Cav1.1. In turns, Cav1.1 directly opens up the type 1 ryanodine receptor (RYR1) in the immediately adjacent SR membrane, through intermolecular conformational coupling. This triggers RYR1-mediated SR Ca2+ release which produces an increase in cytosolic Ca2+ triggering contraction.
Current understanding of the mechanisms involved in the control and regulation of RYR1 channels function is still limited. One reason is related to the fact that detection of RYR1 channel activity in intact muscle fibers is only achieved with indirect methods. Also, whether the SR membrane voltage experiences changes during muscle activity has so far never been experimentally assessed. Yet, deeper knowledge of these processes is essential for our understanding of muscle function in normal and disease conditions.
In this context, the general aim of my PhD project was to design and use fluorescent protein biosensors specifically localized at the SR membrane of differentiated muscle fibers, by fusing them to an appropriate targeting sequence. Thanks to a combination of single cell physiology and biophysics techniques based on electrophysiology and biosensor fluorescence detection, we were able to study the SR activity during muscle fiber function. Specifically, my PhD work focused on two major issues: SR membrane voltage and SR calcium signaling during EC coupling.

The first aim of my work was to characterize SR membrane voltage changes during muscle fiber activity. For this, we used voltage sensitive FRET-biosensors of the Mermaid family. Results show that the SR trans-membrane voltage experiences no substantial change during EC coupling. This provides the first experimental evidence, in physiological conditions, for the existence of ion counter-fluxes that balance the charge deficit associated with RYR1-mediated SR Ca2+ release. Indeed, this process is essential for maintaining the SR Ca2+ flux upon RYR1 channels opening and thus critically important for EC coupling efficiency.

The second objective of my work aimed at detecting the changes in Ca2+ concentration occurring in the immediate vicinity of the RYR1 Ca2+ release channels during muscle fiber activation. For this, we took advantage of one member of the recent generation of genetically encoded Ca2+ biosensors: GCaMP6f. The SR-targeted biosensor provides a unique access to the individual activity of RYR1 channels populations within distinct triads of a same muscle fiber. Beyond allowing a detailed characterization of the biosensor properties in this preparation, results highlight the remarkable uniformity of SR Ca2+ release activation from one triad to another, during EC coupling. These results open up stimulating perspectives for the investigation of disease conditions associated with defective behavior of RYR1 channels.

 


 

Elena Cerutti, A. GIGLIA-MARI team – May 10, 2019

Nucleotide Excision Repair at the crossroad with transcription

The integrity of DNA is continuously challenged by a variety of endogenous and exogenous agents (e.g. ultraviolet light, cigarette smoke, environmental pollution, oxidative damage, etc.) that cause DNA lesions which interfere with proper cellular functions. Nucleotide Excision Repair (NER) mechanism removes helix-distorting DNA adducts such as UV-induced lesions and it exists in two distinct sub-pathways depending where DNA lesions are located within the genome. One of these sub pathways is directly linked to the DNA transcription by RNA Polymerase 2 (TCR). In the first part of this work, we demonstrated that a fully proficient NER mechanism is also necessary for repair of ribosomal DNA, transcribed by RNA polymerase 1 and accounting for the 60 % of the total cellular transcription. Furthermore, we identified and clarified the mechanism of two proteins responsible for the UV-dependent nucleolar repositioning of RNAP1 and rDNA observed during repair. In the second part of this work, we studied the molecular function of the XAB2 protein during NER repair and we demonstrated its involvement in the TCR process. In addition, we also shown the presence of XAB2 in a pre-mRNA splicing complex. Finally, we described the impact of XAB2 on RNAP2 mobility during the first steps of TCR repair, thus suggesting a role of XAB2 in the lesion recognition process.

 


 

Sonia El Mouridi, T. BOULIN team – Oct. 18, 2018

Régulation de l’excitabilité musculaire par le canal potassique EGL-23 et la voie de signalisation LIN-12/Notch chez le nématode C. elegans.

 


 

Philippe Tardy, T. BOULIN team – Sept. 18, 2018

Caractérisation du trafic cellulaire du canal potassique à deux domaines P UNC-58 par la protéine UNC-44 chez le nématode C. elegans.

 


 

Alexis Weinreb, J-L BESSEREAU team – Sept. 11, 2018

Impact de l’activité postsynaptique sur le développement et le maintien de la jonction neuromusculaire de C.elegans.

 


 

Diane Lebrun, C. Marcelle team – June 8, 2018

Caractérisation et généralisation de l’implication de la voie NOTCH cytoplasmique au cours des processus de transition épithélio-mésenchymateuse chez l’embryon de poulet

La transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) est un processus incontournable dans de nombreux contextes normaux et pathologiques, tels que gastrulation, organogenèse, fibroses et cancers. Cette transformation de cellule épithéliale en cellule mésenchymateuse est indissociable de l’acquisition de propriétés migratoires et est généralement associée à un changement de destin cellulaire. Différentes voies moléculaires sont impliquées selon le contexte de l’EMT concernée. Récemment, notre laboratoire a mis en évidence que la voie Notch cytoplasmique contrôle l’EMT des cellules de la lèvre dorso-médiale du somite (DML). Les crêtes neurales exprimant DLL1 activent « en passant » le récepteur NOTCH, liberant ainsi le domaine intra-cytoplasmique de NOTCH (NICD). Dans le cytoplasme, NICD inhibe la kinase GSK3ß, conduisant à la stabilisation de SNAIL, un gène maître de la transition épithélio-mésenchymateuse. Il en résulte une libération de la βcaténine des jonctions adhérentes qui, après translocation dans le noyau, active la transcription des gènes de la myogénèse (Myf5). Ainsi, l’activation de la voie Notch cytoplasmique permet une induction concomitante de l’EMT et de la myogénèse. La fonction cytoplasmique de Notch reste controversée et le mécanisme par lequel NICD inhibe GSK3ß reste obscur.

Au cours de ma thèse j’ai cherché à élucider le mécanisme par lequel NICD inhibe l’activité kinase de GSK3ß. J’ai confirmé l’interaction de GSK3ß et de NICD en démontrant leur interaction via CoIP. Après avoir démontré l’implication de la sérine-thréonie kinase AKT dans la myogenèse des cellules de la DML, j’ai mis en évidence, via CoIP et électroporation, que l’inhibition GSK3ß par NICD est très certainement médiée par AKT, connue pour être impliquée dans l’EMT et inhiber GSK3ß par phosphorylation. En comparant le NICD1 de poulet et les 4 NICD de souris, j’ai montré que l’expression exogène de ces 5 molécules induit l’EMT et la différenciation myogénique de manière similaire. J’ai aussi montré que parmi des différents domaines de NICD, le domaine RAM, connu pour se lier à l’ADN (via RBPJ), est nécessaire et suffisant à l’inhibition de GSK3ß.

Un second axe de ma thèse a été de tester l’implication de la voie Notch cytoplasmique dans d’autres contextes d’EMT. Pour ce faire, j’ai mis en évidence que cette voie est impliquée dans les autres lèvres du dermomyotome mais aussi dans les crêtes neurales qui délaminent du toit du tube neural. J’ai en particulier mis en évidence une co-activation des voies Wnt et Notch, une inhibition de la kinase GSK3ß par NICD cytoplasmique ainsi qu’une inhibition de la différenciation en présence d’une ß-caténine mutée, retenue à la membrane, ou en présence d’une molécule SNAIL2 dominant-négative.
Le dernier axe de ma thèse a consisté à élucider le mécanisme de régulation de l’induction de l’EMT et de la myogenèse via l’activation de NICD. Il a été mis en évidence que toutes les cellules de la DML peuvent être activées via DLL1 et que la surexpression massive de NICD dans la DML provoque une différenciation massive et une déplétion du groupe de cellules progénitrices. Afin de déterminer si la régulation de cette initiation se fait avant ou après induction de NICD, j’ai créé un plasmide permettant de répondre à cette question et afin de visualiser son expression in vivo, j’ai initié une collaboration avec une équipe de l’ILM afin de créer un microscope vertical SPIM biphoton permettant l’observation d’embryon de poulets vivants. Ce projet est encore en cours.

Ainsi, mon travail de thèse a permis de i) préciser le mécanisme par lequel NOTCH et GSK3ß interagissent physiquement au niveau cytoplasmique lors de l’induction de l’EMT et de la myogenèse des cellules de la DML et j’ai ajouté un nouvel acteur à ce complexe, AKT qui permettrait de médier l’inhibition de GSK3ß par NICD via phosphorylation, de ii) démontrer que cette voie Notch cytoplasmique est présente dans au moins deux autres EMT embryonnaires, celles de la lèvre ventro-latérale du somite et celle des crêtes neurales, et iii) de mettre en place de nouveaux outils d’imagerie in vivo pour explorer les aspects dynamiques de ces mécanismes.

 


 

Isabella Scionti, L. Schaeffer team – Nov. 20, 2017

Epigenetic regulation of skeletal muscle differentiation

Isabella Scionti- Directeur de thèse Laurent SCHAEFFER- equipe Schaeffer

LSD1 and PHF2 are lysine de-methylases that can de-methylate both histone proteins, influencing gene expressionand non-histone proteins, affecting their activity or stability. Functional approaches using Lsd1or Phf2 inactivation in mouse have demonstrated the involvement of these enzymes in the engagement of progenitor cells into differentiation.

One of the best-characterized examples of how progenitor cells multiply and differentiate to form functional organ is myogenesis. It is initiated by the specific timing expression of the specific regulatory genes; among these factors, MYOD is a key regulator of the engagement into differentiation of muscle progenitor cells. Although the action of MYOD during muscle differentiation has been extensively studied, still little is known about the chromatin remodeling events associated with the activation of MyoDexpression. Among the regulatory regions of MyoDexpression, the Core Enhancer region (CE), which transcribes for a non-coding enhancer RNA (CEeRNA), has been demonstrated to control the initiation of MyoDexpression during myoblast commitment.

We identified LSD1 and PHF2 as key activators of the MyoDCE. In vitroand in vivoablation of LSD1 or inhibition of LSD1 enzymatic activity impaired the recruitment of RNA PolII on the CE, resulting in a failed expression of the CEeRNA. According to our results, forced expression of the CEeRNA efficiently rescue MyoDexpression and myoblast fusion in the absence of LSD1. Moreover PHF2 interacts with LSD1 regulating its protein stability. Indeed in vitroablation of PHF2 results in a massive LSD1 degradation and thus absence of CEeRNA expression. However, all the histone modifications occurring on the CE region upon activation cannot be directly attributed to LSD1 or PHF2 enzymatic activity.

These results raise the question of the identity of LSD1 and PHF2 partners, which co-participate to CEeRNA expression and thus to the engagement of myoblast cells into differentiation.

 


 

Adeline Mergoud dit Lamarche, J-L BESSEREAU team – July 13, 2016

Étude des modifications subcellulaire associées au vieillissement musculaire chez Caenorhabditis elegans– Rôle du facteur de transcription UNC-120/SRF.

 


 

Viviane Lainé, J-L BESSEREAU team – June 23, 2016

Conséquences fonctionnelles de la suractivation des récepteurs de l’acétylcholine et des canaux calciques de type L sur l’homéostasie des cellules musculaires striées de Caenorhabditis elegans.