Nathalie Couturier, V. Gache team – June 09, 2020

Identification of new regulators of myonuclei positioning during skeletal muscle fibers development

Skeletal muscle fibers are built from fusion of myoblasts allowing the formation of myotubes. Those syncytia contain hundreds of nuclei that undergo many movements, simultaneously with myotubes maturation process, until reaching a final peripheric localization in mature fibers (myofibers). Disorganization of nuclei disposal is always associated with myofibers misfunctioning (i.e.: sarcopenia, centronuclear myopathy). Peripheral nuclei positioning in mature fiber appears to be essential for their functionality. Understanding the process of nuclei positioning turned up as key point.

Involvement of molecular motors are known in spacing myonuclei in the first steps of muscle differentiation, however the role of microtubules associated proteins (Maps) is less described. Consequently, identify new Maps involved in nuclei positioning during muscle formation may 1) provide a better understanding of muscle differentiation; 2) bring to light new targets potentially involved in pathologies presenting nuclei mispositioning.

In this context, my thesis work consisted in identifying proteins linked to microtubules, directly or indirectly, and involved in the regulation of myonuclei positioning throughout skeletal muscle fibers differentiation. Proteomes associated to microtubules and differentially expressed during muscle differentiation were identified using a mass-spectrometry analysis. Based on this identification, 239 proteins from the total cellular extracts of myotubes and myofibers; and 240 proteins identified in proteomes linked to microtubules were selected. A siRNA screen was performed on primary myotubes in order to decipher the involvement of those selected targets in myonuclei positioning during the first steps of muscle differentiation. This siRNA screen allowed the identification of three proteins which roles on myonuclei positioning appeared to be crucial.

Unexpectedly, we identified a cytoplasmic role of the mitotic protein NuMA1 in muscle biology field. This protein progressively accumulates into the cytoplasm where it stabilizes microtubule network in differentiating myofibers. This cytoplasmic fraction of NuMA1 proteins, in association with the dynein, regulates microtubule network architecture and myonuclei spacing. Its role is also crucial in maintaining peripherized myonuclei in mature myofibers and in neuromuscular junction regions.

Keywords: Skeletal muscle development, nuclei movements, microtubules, MAPs, primary muscle cells, sarcopenia, centronuclear myopathy, NuMA1

 


Nicolas Chatron, Équipe J. Courchet – 20 Décembre 2019

Remaniements chromosomiques complexes : de la caractérisation aux conséquences fonctionnelles

La cytogénétique humaine est une discipline visant à l’étude de la structure et de la fonction des chromosomes de notre espèce. Au début des années 2010, le séquençage de génome a révélé des remaniements chromosomiques d’une complexité encore inconnue, dénommés chromoanagenesis. Si une importante proportion de génomes tumoraux présentent ce type d’anomalies, les descriptions de cas constitutionnels sont rares et les mécanismes sous-jacents mal compris. Nous rapportons ici le séquençage de génome de 20 nouveaux cas de chromoanagenesis constitutionnels (6 équilibrés et 14 déséquilibrés), constituant la plus large cohorte à ce jour. Chez plusieurs patients, des loci de moins d’un kilobase apparaissent plusieurs fois dans le remaniement dans ce que nous nommons un « hub ». L’étude de la distribution des points de cassure de ces chromoanagenesis et de ceux de la littérature a montré que la réplication tardive de la chromatine était le « facteur de risque » principal de cassure chromosomique. Ce résultat vient apporter une démonstration orthogonale à l’hypothèse de condensation prématurée d’un chromosome à l’origine de ces remaniements et montre pour la première fois une origine commune aux chromoanagenesis constitutionnels et tumoraux. Parallèlement, la distribution des points de cassure de remaniements simples apparaît biaisée vers le centre du noyau ouvrant d’importantes voies de recherche. Pour mieux comprendre les conséquences de ces remaniements complexes sur le fonctionnement du génome nous avons étudié le transcriptome des 6 cas de chromoanagenesis équilibrés. Nous n’avons pas mis en évidence de dérégulation massive du génome. Même localement, à proximité des points de cassure, il n’apparaît pas de dérégulation de l’expression génique posant là encore d’importantes questions sur les mécanismes de « résistance » aux remaniements.
La détection de remaniements chromosomiques n’est aujourd’hui (presque) plus limitée par la technologie (séquençage short-read, long-read, linked-read, cartographie optique). La compréhension des mécanismes à leur origine, la connaissance de leur pouvoir pathogène et plus généralement la maîtrise de la biologie du génome sont les nouvelles limites à la corrélation génotype/phénotype. Par l’étude des chromoanagenesis, d’un exceptionnel transcrit de fusion chez un patient hémophile et la description d’éléments transposables méconnus (rétrocopies) nous apportons d’importants nouveaux éléments.
 


Hugo Ducuing, Équipe V. Castellani – 17 Décembre 2019

Étude fonctionnelle de la signalisation PlexinA1/SlitC dans le guidage des axones commissuraux de la moelle épinière
musculaire

Chez les bilatériens, les commissures sont des circuits neuronaux interconnectant les deux moitiés du système nerveux central. Elles sont essentielles pour l’intégration et la coordination des modalité sensorielles, des commandes motrices et le traitement des fonctions cérébrales. Au cours du développement embryonnaire, les neurones commissuraux étendent un axone qui traverse la ligne médiane de l’organisme pour se connecter à sa cible finale. Cette navigation est hautement stéréotypée et contrôlée, à chacune de ses étapes, par une multitude de signalisations de guidage axonal.
Au sein de la moelle épinière, certains neurones commissuraux naissent d’un territoire dorsal. Leurs axones croissent ventralement et traversent la ligne médiane au sein d’un territoire particulier : la plaque du plancher (PP). Ils naviguent à travers les pieds des cellules gliales qui composent la PP et acquièrent au cours de leur progression la capacité de répondre aux signaux répulsifs présents dans la PP. Ce gain de sensibilité aux signaux répulsifs permet de : 1) expulser les axones de la PP, qui s’orientent alors rostralement et continuent leur navigation vers leurs cibles finales et, 2) empêcher les axones de retraverser la ligne médiane en jouant un rôle de barrière. Au cours des dernières décennies, différentes équipes ont identifié les principales signalisations répulsives de la PP : la Semaphorin3B (Sema3B) via le complexe de récepteurs PlexinA1 (PlxnA1) – Neuropilin-2 (Nrp2), SlitC via le récepteur PlxnA1 et SlitN via les récepteurs Roundabout1-2 (Robo1-2). Cependant, les contributions précises et les spécificités fonctionnelles de ces différentes signalisations restent incomprises.
Au cours de ma thèse j’ai participé dans un premier temps à une étude visant à comprendre si la génération de spécificités fonctionnelles des signalisations répulsives pouvait résulter de dynamiques spatiales et temporelles propres à chaque récepteur de guidage à la surface du cône de croissance (CC). J’ai en particulier mis au point un paradigme de FRAP (récupération de fluorescence après photoblanchiment) sur des moelles épinières embryonnaires natives, et réalisé des expériences sur des CC électroporés avec des récepteurs de guidage fusionnés à la pHluorin, une GFP sensible au pH permettant de suivre le pool membranaire de récepteurs. Ces expériences ont permis d’étudier la dynamique de récepteurs pendant la traversée de la PP et de montrer que l’exocytose de PlxnA1 est significativement plus forte que celle de Robo1. J’ai également imagé en super-résolution les pools membranaire et total de différents récepteurs dans des CC naviguant la PP. L’analyse de ces images a permis de mettre en évidence une localisation membranaire spécifique pour PlxnA1 et Robo1 au sein du CC. Plus généralement, ces résultats ont révélé une séquence unique d’adressage des récepteurs à la surface des CC, qui pourrait leur permettre de discriminer fonctionnellement les différents signaux répulsifs.
Mes travaux de thèse ont ensuite porté sur la spécificité fonctionnelle d’une de ces signalisations : SlitC-PlxnA1. Suite à une précédente étude de notre équipe montrant que la mutation Y1815F de PlxnA1 permet d’abroger in vitro spécifiquement la signalisation de SlitC mais pas celle de Sema3B, nous avons généré un modèle de souris portant cette mutation. J’ai tout d’abord analysé les phénotypes de guidage des axones commissuraux dans ce modèle, et observé des défauts qui permettent de proposer que la signalisation SlitC-PlxnA1 empêche spécifiquement les axones d’effectuer des demi-tours lors de la traversée de la ligne médiane. En réintroduisant PlxnA1Y1815F fusionné à la pHluorin dans la moelle épinière d’embryons PlxnA1-/-, j’ai pu montrer que le récepteur muté est incapable de sauver ce phénotype de demi-tours. Je me suis ensuite intéressé aux impacts de la mutation Y1815F sur PlxnA1. Tout d’abord, j’ai montré que PlxnA1Y1815F est bien exprimée par les neurones commissuraux et son patron temporel d’adressage à la membrane présente toutefois des différences avec celui du récepteur natif. De plus, j’ai pu mettre en évidence que l’expression de surface de PlxnA1Y1815F est altérée, aussi bien in vivo, lorsque le récepteur est ré-exprimé dans la moelle épinière embryonnaire, qu’in vitro, dans un modèle cellulaire N2a et des cultures de neurones commissuraux. Enfin, je me suis intéressé aux interacteurs de PlxnA1 en comparant les partenaires du récepteur natif et muté par une approche de spectrométrie de masse. Les analyses ont permis d’établir une première liste de candidats dont l’interaction au récepteur pourrait être perturbée par la mutation Y1815F. Des expériences complémentaires sont en cours pour valider ces altérations.
 


Jessica Bouvière, Équipe B. Chazaud – 30 Septembre 2019

Rôle de la sélénoprotéine P et de la glutathion peroxydase 3 dans le phénotype des macrophages et la régénération musculaire

Directeur: Rémi Mounier

Après une lésion musculaire, la réparation du tissu est régulée par différentes cellules et notamment par les macrophages qui orchestrent à la fois la réponse inflammatoire et la résolution de l’inflammation, permettant la régénération tissulaire. Après une lésion, les macrophages pro-inflammatoires activent la prolifération des cellules myogéniques et phagocytent les débris cellulaires. Ce processus cellulaire promeut l’activation d’un état anti- inflammatoire des macrophages qui stimule la fusion des cellules myogéniques. Les effecteurs grâce auxquels les macrophages anti-inflammatoires ont des effets pro-myogéniques sont peu décrits. Grâce à un transcriptome/sécrétome comparant les protéines sécrétées par les macrophages humains pro et anti-inflammatoires, nous avons identifié deux molécules antioxydantes : la sélénoprotéine P (SEPP1) et la glutathion peroxydase 3 (GPX3) dont les fonctions restent faiblement caractérisées dans la biologie musculaire et l’inflammation. Nos résultats montrent que GPX3 et SEPP1 sont impliqués dans la fonction anti-inflammatoire des macrophages, dans la stimulation des dernières étapes de la myogenèse. In vivo, ces deux sélénoprotéines sont nécessaires à l’homéostasie du muscle squelettique. En utilisant un modèle de lésion du muscle squelettique d’animaux dépourvus de sélénoprotéine dans les macrophages (modèle LysMCre/+ Sepp1fl/fl), nous avons constaté que l’absence de SEPP1 perturbe le passage d’un phénotype pro-inflammatoire vers un phénotype anti-inflammatoire au cours de la régénération musculaire.

Ainsi, nous avons mis en évidence pour la première fois le rôle des sélénoprotéines sécrétées par les macrophages dans la réparation des tissus, établissant un lien entre molécules antioxydantes et résolution de l’inflammation.
 


Colline Sanchez, Équipe V. Jacquemond – 27 Septembre 2019

Investigating sarcoplasmic reticulum function during skeletal muscle excitation-contraction coupling using fluorescent biosensors

Excitation-contraction (EC) coupling in skeletal muscle corresponds to the sequence of events through which muscle fiber contraction is triggered in response to plasma membrane electrical activity. EC coupling takes place at the triads; these are nanoscopic domains in which the transverse invaginations (t-tubules) of the surface membrane are in close apposition with two adjacent terminal cisternae of the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. More precisely, EC coupling starts with action potentials fired at the endplate, propagating throughout the surface membrane and in depth into the muscle fiber through the t-tubules network. When reaching the triadic region, action potentials activate the voltage-sensing protein Cav1.1. In turns, Cav1.1 directly opens up the type 1 ryanodine receptor (RYR1) in the immediately adjacent SR membrane, through intermolecular conformational coupling. This triggers RYR1-mediated SR Ca2+ release which produces an increase in cytosolic Ca2+ triggering contraction.
Current understanding of the mechanisms involved in the control and regulation of RYR1 channels function is still limited. One reason is related to the fact that detection of RYR1 channel activity in intact muscle fibers is only achieved with indirect methods. Also, whether the SR membrane voltage experiences changes during muscle activity has so far never been experimentally assessed. Yet, deeper knowledge of these processes is essential for our understanding of muscle function in normal and disease conditions.
In this context, the general aim of my PhD project was to design and use fluorescent protein biosensors specifically localized at the SR membrane of differentiated muscle fibers, by fusing them to an appropriate targeting sequence. Thanks to a combination of single cell physiology and biophysics techniques based on electrophysiology and biosensor fluorescence detection, we were able to study the SR activity during muscle fiber function. Specifically, my PhD work focused on two major issues: SR membrane voltage and SR calcium signaling during EC coupling.

The first aim of my work was to characterize SR membrane voltage changes during muscle fiber activity. For this, we used voltage sensitive FRET-biosensors of the Mermaid family. Results show that the SR trans-membrane voltage experiences no substantial change during EC coupling. This provides the first experimental evidence, in physiological conditions, for the existence of ion counter-fluxes that balance the charge deficit associated with RYR1-mediated SR Ca2+ release. Indeed, this process is essential for maintaining the SR Ca2+ flux upon RYR1 channels opening and thus critically important for EC coupling efficiency.

The second objective of my work aimed at detecting the changes in Ca2+ concentration occurring in the immediate vicinity of the RYR1 Ca2+ release channels during muscle fiber activation. For this, we took advantage of one member of the recent generation of genetically encoded Ca2+ biosensors: GCaMP6f. The SR-targeted biosensor provides a unique access to the individual activity of RYR1 channels populations within distinct triads of a same muscle fiber. Beyond allowing a detailed characterization of the biosensor properties in this preparation, results highlight the remarkable uniformity of SR Ca2+ release activation from one triad to another, during EC coupling. These results open up stimulating perspectives for the investigation of disease conditions associated with defective behavior of RYR1 channels.

Keywords: skeletal muscle; excitation-contraction coupling; sarcoplasmic reticulum; ryanodine receptor; fluorescent biosensors; membrane voltage; intracellular calcium.
 


Thibaut Desgeorges, Équipe B. Chazaud – 22 Mai 2019

Interactions entre le Récepteur aux glucocorticoïdes et l’AMP-activated protein kinase dans les macrophages au cours de la régénération du muscle strié squelettique

Directeurs: Rémi Mounier & Bénédicte Chazaud

Le muscle strié squelettique régénère ad integrum après une lésion aigüe stérile grâce aux cellules satellites qui sont les cellules souches du muscle strié squelettique. L’inflammation, et notamment les macrophages, joue un rôle important durant ce processus. En effet, après une lésion, les monocytes sanguins infiltrent le tissu et deviennent des macrophages avec un phénotype pro-inflammatoire associé à la lésion. Ces macrophages phagocytent les débris cellulaires et promeuvent la prolifération des cellules souches musculaires. Ensuite, les macrophages changent leur phénotype vers un phénotype anti-inflammatoire associé à la restauration du tissu. Ils promeuvent la différenciation, puis la fusion des cellules souches musculaires et la croissance des myofibres. Cette séquence de phénotypes inflammatoires est essentielle pour une régénération musculaire efficace. Le laboratoire a montré que ce changement de phénotype est dépendant d’un senseur énergétique majeur de la cellule qui contrôle le métabolisme cellulaire, l’AMP kinase (AMPK)α1. Par ailleurs, les glucocorticoïdes sont utilisés depuis des décennies pour leurs effets anti-inflammatoires sur l’inflammation. Leur action est médiée par le Récepteur aux Glucocorticoïdes qui induit ou réprime l’expression de gènes par interaction directe ou indirecte sur l’ADN. Comme l’AMPKα1 et les glucocorticoïdes induisent des effets anti- inflammatoires similaires sur les macrophages, nous avons posé l’hypothèse que ces 2 voies de signalisation pourraient être interconnectées dans les macrophages afin de permettre leur changement de phénotype au cours de la régénération musculaire. Les données issues d’un modèle in vitro de lésion musculaire utilisant des macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris ont montré que : i) les glucocorticoïdes induisaient la phosphorylation de l’AMPKα1 ; ii) l’AMPKα1 était requise pour l’acquisition fonctionnelle du statut anti-inflammatoire des macrophages induit par les glucocorticoïdes puisque des macrophages déficients pour l’AMPKα1 ne modifiaient pas leur phénotype et ne stimulaient pas la myogenèse. Les expériences in vivo utilisant des souris LysMCre/+;AMPKα1fl/fl dans lesquelles l’AMPKα1 est invalidée uniquement dans les cellules myéloïdes ont montré que l’AMPK dans les macrophages régulait les effets bénéfiques des glucocorticoïdes au cours de la régénération du muscle strié squelettique. En effet, en absence d’AMPK dans les macrophages, les GCs induisaient un retard de régénération et une modification de la maturation des fibres attestée par une modification de l’expression des chaînes lourdes de myosines. En conclusion, ces données montrent que l’AMPKα1 est requise pour le changement de phénotype des macrophages induit par les glucocorticoïdes afin de permettre la régénération musculaire.

Mots-clés: muscle, régénération, macrophages, AMPK, glucocorticoïdes
 


Elena Cerutti, Équipe A. GIGLIA-MARI – 10 mai 2019

Nucleotide Excision Repair at the crossroad with transcription

The integrity of DNA is continuously challenged by a variety of endogenous and exogenous agents (e.g. ultraviolet light, cigarette smoke, environmental pollution, oxidative damage, etc.) that cause DNA lesions which interfere with proper cellular functions. Nucleotide Excision Repair (NER) mechanism removes helix-distorting DNA adducts such as UV-induced lesions and it exists in two distinct sub-pathways depending where DNA lesions are located within the genome. One of these sub pathways is directly linked to the DNA transcription by RNA Polymerase 2 (TCR). In the first part of this work, we demonstrated that a fully proficient NER mechanism is also necessary for repair of ribosomal DNA, transcribed by RNA polymerase 1 and accounting for the 60 % of the total cellular transcription. Furthermore, we identified and clarified the mechanism of two proteins responsible for the UV-dependent nucleolar repositioning of RNAP1 and rDNA observed during repair. In the second part of this work, we studied the molecular function of the XAB2 protein during NER repair and we demonstrated its involvement in the TCR process. In addition, we also shown the presence of XAB2 in a pre-mRNA splicing complex. Finally, we described the impact of XAB2 on RNAP2 mobility during the first steps of TCR repair, thus suggesting a role of XAB2 in the lesion recognition process.
 


Linda Gsaier, Équipe B. Chazaud – 22 Octobre 2018

Rôle du métabolisme sur le devenir des cellules souches musculaires et l’homéostasie du muscle squelettique

Directeur: Rémi Mounier

Durant la régénération du muscle suite à une lésion, les cellules souches musculaires, aussi appelées les cellules satellites, quittent leur état de quiescence et s’activent. Elles pourront soit emprunter la voie de la myogenèse afin de former de nouvelles fibres musculaires, soit retourner à leur état de quiescence pour reformer la réserve de cellules souches mobilisable en cas de lésion ultérieure. La régulation du devenir de la cellule souche est modulée par de nombreuses voies de signalisation telles que la voie Wnt, la voie Notch ou la voie des TGFß. Cependant, rares sont les données concernant l’implication du métabolisme sur le devenir de la cellule souche. Pourtant il a été démontré que l’activation des cellules satellites est étroitement liée avec le métabolisme cellulaire, dont l’un des principaux acteurs est la protéine kinase AMPK. Ce complexe hétérotrimérique, composé de trois sous-unités α, ß et 𝜸, et est responsable de l’équilibre entre consommation énergétique et production d’énergie au sein de la cellule. Grâce à la modulation de mTORC1, il a également été prouvé que l’AMPKα1 était responsable de la croissance cellulaire et de la prolifération des précurseurs myogéniques. A l’aide de différents modè les murins, de ligné es primaires et de cellules satellites en sortie de tri, nous avons déterminé le rôle que pouvait jouer chacun des isoformes, AMPKα1 et AMPKα2 au sein de la cellule souche, sur le déroulement de la myogenèse adulte post-lésionnelle ainsi que sur l’homéostasie du muscle régénéré. Dans un premier temps nous avons démontré que la voie de signalisation AMPK 1-LDH permettait de réguler l’autorenouvellement des cellules satellites grâce au contrôle du métabolisme. En effet, au moment de l’entrée de la cellule dans la voie de la différenciation, la voie de l’AMPK 1 induit une diminution de l’activité de la LDH, permettant aux cellules d’adopter un métabolisme de phosphorylation oxydative répondant à leurs besoins énergétiques. Dans un second temps, nous avons démontré que l’isoforme AMPKα2, exprimé uniquement après l’entrée de la cellule dans la voie de la myogenèse, était responsable d’une modulation de la régénération musculaire et que son absence induisait un dé faut de différenciation et un retard de maturation des fibres néoformées. Nos travaux nous ont ainsi permis de confirmer la place centrale de la proté ine kinase AMPK dans la modulation via le mé tabolisme du devenir de la cellule souche musculaire dans un contexte de régénération du tissu musculaire squelettique dans un modè le murin.

Mots-clés: muscle, régénération, métabolisme, myogenèse, AMPK
 


Sonia El Mouridi, Équipe T. BOULIN – 18 Octobre 2018

Régulation de l’excitabilité musculaire par le canal potassique EGL-23 et la voie de signalisation LIN-12/Notch chez le nématode C. elegans.
 


Philippe Tardy, Équipe T. BOULIN – 18 Septembre 2018

Caractérisation du trafic cellulaire du canal potassique à deux domaines P UNC-58 par la protéine UNC-44 chez le nématode C. elegans.
 


Alexis Weinreb, Équipe J-L BESSEREAU – 11 Septembre 2018

Impact de l’activité postsynaptique sur le développement et le maintien de la jonction neuromusculaire de C.elegans.
 


Diane Lebrun, Équipe C. Marcelle – 8 Juin 2018

Caractérisation et généralisation de l’implication de la voie NOTCH cytoplasmique au cours des processus de transition épithélio-mésenchymateuse chez l’embryon de poulet

La transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) est un processus incontournable dans de nombreux contextes normaux et pathologiques, tels que gastrulation, organogenèse, fibroses et cancers. Cette transformation de cellule épithéliale en cellule mésenchymateuse est indissociable de l’acquisition de propriétés migratoires et est généralement associée à un changement de destin cellulaire. Différentes voies moléculaires sont impliquées selon le contexte de l’EMT concernée. Récemment, notre laboratoire a mis en évidence que la voie Notch cytoplasmique contrôle l’EMT des cellules de la lèvre dorso-médiale du somite (DML). Les crêtes neurales exprimant DLL1 activent « en passant » le récepteur NOTCH, liberant ainsi le domaine intra-cytoplasmique de NOTCH (NICD). Dans le cytoplasme, NICD inhibe la kinase GSK3ß, conduisant à la stabilisation de SNAIL, un gène maître de la transition épithélio-mésenchymateuse. Il en résulte une libération de la βcaténine des jonctions adhérentes qui, après translocation dans le noyau, active la transcription des gènes de la myogénèse (Myf5). Ainsi, l’activation de la voie Notch cytoplasmique permet une induction concomitante de l’EMT et de la myogénèse. La fonction cytoplasmique de Notch reste controversée et le mécanisme par lequel NICD inhibe GSK3ß reste obscur.

Au cours de ma thèse j’ai cherché à élucider le mécanisme par lequel NICD inhibe l’activité kinase de GSK3ß. J’ai confirmé l’interaction de GSK3ß et de NICD en démontrant leur interaction via CoIP. Après avoir démontré l’implication de la sérine-thréonie kinase AKT dans la myogenèse des cellules de la DML, j’ai mis en évidence, via CoIP et électroporation, que l’inhibition GSK3ß par NICD est très certainement médiée par AKT, connue pour être impliquée dans l’EMT et inhiber GSK3ß par phosphorylation. En comparant le NICD1 de poulet et les 4 NICD de souris, j’ai montré que l’expression exogène de ces 5 molécules induit l’EMT et la différenciation myogénique de manière similaire. J’ai aussi montré que parmi des différents domaines de NICD, le domaine RAM, connu pour se lier à l’ADN (via RBPJ), est nécessaire et suffisant à l’inhibition de GSK3ß.

Un second axe de ma thèse a été de tester l’implication de la voie Notch cytoplasmique dans d’autres contextes d’EMT. Pour ce faire, j’ai mis en évidence que cette voie est impliquée dans les autres lèvres du dermomyotome mais aussi dans les crêtes neurales qui délaminent du toit du tube neural. J’ai en particulier mis en évidence une co-activation des voies Wnt et Notch, une inhibition de la kinase GSK3ß par NICD cytoplasmique ainsi qu’une inhibition de la différenciation en présence d’une ß-caténine mutée, retenue à la membrane, ou en présence d’une molécule SNAIL2 dominant-négative.
Le dernier axe de ma thèse a consisté à élucider le mécanisme de régulation de l’induction de l’EMT et de la myogenèse via l’activation de NICD. Il a été mis en évidence que toutes les cellules de la DML peuvent être activées via DLL1 et que la surexpression massive de NICD dans la DML provoque une différenciation massive et une déplétion du groupe de cellules progénitrices. Afin de déterminer si la régulation de cette initiation se fait avant ou après induction de NICD, j’ai créé un plasmide permettant de répondre à cette question et afin de visualiser son expression in vivo, j’ai initié une collaboration avec une équipe de l’ILM afin de créer un microscope vertical SPIM biphoton permettant l’observation d’embryon de poulets vivants. Ce projet est encore en cours.

Ainsi, mon travail de thèse a permis de i) préciser le mécanisme par lequel NOTCH et GSK3ß interagissent physiquement au niveau cytoplasmique lors de l’induction de l’EMT et de la myogenèse des cellules de la DML et j’ai ajouté un nouvel acteur à ce complexe, AKT qui permettrait de médier l’inhibition de GSK3ß par NICD via phosphorylation, de ii) démontrer que cette voie Notch cytoplasmique est présente dans au moins deux autres EMT embryonnaires, celles de la lèvre ventro-latérale du somite et celle des crêtes neurales, et iii) de mettre en place de nouveaux outils d’imagerie in vivo pour explorer les aspects dynamiques de ces mécanismes.
 


Isabella Scionti, Équipe L. Schaeffer – 20 Novembre 2017

Epigenetic regulation of skeletal muscle differentiation

Directeur de thèse: Laurent SCHAEFFER

LSD1 and PHF2 are lysine de-methylases that can de-methylate both histone proteins, influencing gene expressionand non-histone proteins, affecting their activity or stability. Functional approaches using Lsd1or Phf2 inactivation in mouse have demonstrated the involvement of these enzymes in the engagement of progenitor cells into differentiation.

One of the best-characterized examples of how progenitor cells multiply and differentiate to form functional organ is myogenesis. It is initiated by the specific timing expression of the specific regulatory genes; among these factors, MYOD is a key regulator of the engagement into differentiation of muscle progenitor cells. Although the action of MYOD during muscle differentiation has been extensively studied, still little is known about the chromatin remodeling events associated with the activation of MyoDexpression. Among the regulatory regions of MyoDexpression, the Core Enhancer region (CE), which transcribes for a non-coding enhancer RNA (CEeRNA), has been demonstrated to control the initiation of MyoDexpression during myoblast commitment.

We identified LSD1 and PHF2 as key activators of the MyoDCE. In vitroand in vivoablation of LSD1 or inhibition of LSD1 enzymatic activity impaired the recruitment of RNA PolII on the CE, resulting in a failed expression of the CEeRNA. According to our results, forced expression of the CEeRNA efficiently rescue MyoDexpression and myoblast fusion in the absence of LSD1. Moreover PHF2 interacts with LSD1 regulating its protein stability. Indeed in vitroablation of PHF2 results in a massive LSD1 degradation and thus absence of CEeRNA expression. However, all the histone modifications occurring on the CE region upon activation cannot be directly attributed to LSD1 or PHF2 enzymatic activity.

These results raise the question of the identity of LSD1 and PHF2 partners, which co-participate to CEeRNA expression and thus to the engagement of myoblast cells into differentiation.
 


Adeline Mergoud dit Lamarche, Équipe J-L BESSEREAU – 13 Juillet 2016

Étude des modifications subcellulaire associées au vieillissement musculaire chez Caenorhabditis elegans– Rôle du facteur de transcription UNC-120/SRF.
 


Viviane Lainé, Équipe J-L BESSEREAU – 23 Juin 2016

Conséquences fonctionnelles de la suractivation des récepteurs de l’acétylcholine et des canaux calciques de type L sur l’homéostasie des cellules musculaires striées de Caenorhabditis elegans.